清晨新選組第六隊隊長井上源三郎的屍體被人在水中發現，而人群中一個帶著壺頭盔的男人分外可疑。
我們在來到新選組駐地後才得知該消息，隨後沖田總司率領第一隊前往京都調查殺人兇手。
為了防止沖田濫殺無辜，土方讓我們前去發現井上實體的地點組織沖田。
在剛剛來到京都時就看到有新選組的隊士傷及無辜，我們只得出手阻攔將其擊敗。
來到碼頭後並未見到沖田和第一隊的身影，通過山崎我們得知沖田現在正在骸街尋找【虛無僧】。
在途中我們會經常遭遇為非作歹的第一隊隊員，出手將其打敗阻止他們繼續禍害無辜者。
來到骸街後在海邊通過樓梯上到二層。
見到沖天後他突然對我們發起攻擊，並表示在勤王派之間流傳的情報表示，坂本龍馬就是虛無僧。
同時他告訴我們井上就是當年的忍者，因此我們也有充足的動機殺死井上。
與沖田戰鬥並將其擊敗，需要注意的是沖田的攻擊方法與之前完全不同，注意及時變更應對策略。
但在殘血QTE後沖田仍然會切換至小太刀戰鬥，且之前身體後仰蓄力的大招同樣會使用出來。
擊敗沖田後近藤突然出現，隨後從他的口中我們得知了當年事情的真相。芹澤鴨、平山五郎和平間重助來自最為神秘的水戶藩，和近藤勇一起成立了新選組。
而井上、沖田和永倉並不信任這三名外來人，在芹澤鴨暗殺東洋老爹的那天晚上想要將其全部殺死。
由於井上三人組技不如人而遭到反殺，但為了保住新選組的名號，近藤提議眾人身份互換。
自此之後水戶藩三人組便頂替了井上三人組的身份，繼續生活在新選組中。
與此同時近藤透露，委託芹澤鴨暗殺東陽老爹的人正是坂本龍馬。經過調查坂本龍馬經常下榻寺田屋，於是眾人決定前往寺田屋將其捉拿。
來到寺田屋後發現伊東和武田已經守在此處，沖田以近藤有事與移動商議為藉口將伊東成功支走。
為了避免傷及無辜，我們從後門通知阿龍讓她先和老闆娘離開暫避風頭，但沒想到阿龍突然大聲呼喊讓坂本龍馬趕快離開。
無奈之下只得強行攻入寺田屋，擊敗勤王志士的同時尋找坂本龍馬的下落。
來到寺田屋最上層後找到坂本龍馬，而他正是之前在圍觀井上屍體人群中帶著壺面具的男人，也就是沖田一直在尋找的虛無僧。
擊敗虛無僧後他找準機會從寺田屋中逃走，但通過被刀刃劃開的衣服我們可以看到與武市一摸一樣的燒傷傷疤。
戰鬥結束後聽命於【勝鱗太郎】的見回組姍姍來遲，並表示坂本龍馬的事情歸他們負責，將新選組排除在了事件之外。
回到新選組駐地後伊東、武田和藤堂對沖田支開他們的形為明顯感到不滿。
回到寺田屋後與阿龍交談，在老闆娘的勸說下阿龍終於吐露實情，由此我們也得知她通過向勤王派傳遞消息來賺錢，同時也是給自己被新選組害死的父親報仇。
在向阿龍表明自己的真實身份後，阿龍告訴我們新選組的山崎也許會和假的坂本龍馬所有牽連，下一步行動可以通過山崎入手。
