清晨新选组第六队队长井上源三郎的尸体被人在水中发现，而人群中一个带着壶头盔的男人分外可疑。
我们在来到新选组驻地后才得知该消息，随后冲田总司率领第一队前往京都调查杀人凶手。
为了防止冲田滥杀无辜，土方让我们前去发现井上实体的地点组织冲田。
在刚刚来到京都时就看到有新选组的队士伤及无辜，我们只得出手阻拦将其击败。
来到码头后并未见到冲田和第一队的身影，通过山崎我们得知冲田现在正在骸街寻找【虚无僧】。
在途中我们会经常遭遇为非作歹的第一队队员，出手将其打败阻止他们继续祸害无辜者。
来到骸街后在海边通过楼梯上到二层。
见到冲天后他突然对我们发起攻击，并表示在勤王派之间流传的情报表示，坂本龙马就是虚无僧。
同时他告诉我们井上就是当年的忍者，因此我们也有充足的动机杀死井上。
与冲田战斗并将其击败，需要注意的是冲田的攻击方法与之前完全不同，注意及时变更应对策略。
但在残血QTE后冲田仍然会切换至小太刀战斗，且之前身体后仰蓄力的大招同样会使用出来。
击败冲田后近藤突然出现，随后从他的口中我们得知了当年事情的真相。芹泽鸭、平山五郎和平间重助来自最为神秘的水户藩，和近藤勇一起成立了新选组。
而井上、冲田和永仓并不信任这三名外来人，在芹泽鸭暗杀东洋老爹的那天晚上想要将其全部杀死。
由于井上三人组技不如人而遭到反杀，但为了保住新选组的名号，近藤提议众人身份互换。
自此之后水户藩三人组便顶替了井上三人组的身份，继续生活在新选组中。
与此同时近藤透露，委托芹泽鸭暗杀东阳老爹的人正是坂本龙马。经过调查坂本龙马经常下榻寺田屋，于是众人决定前往寺田屋将其捉拿。
来到寺田屋后发现伊东和武田已经守在此处，冲田以近藤有事与移动商议为借口将伊东成功支走。
为了避免伤及无辜，我们从后门通知阿龙让她先和老板娘离开暂避风头，但没想到阿龙突然大声呼喊让坂本龙马赶快离开。
无奈之下只得强行攻入寺田屋，击败勤王志士的同时寻找坂本龙马的下落。
来到寺田屋最上层后找到坂本龙马，而他正是之前在围观井上尸体人群中带着壶面具的男人，也就是冲田一直在寻找的虚无僧。
击败虚无僧后他找准机会从寺田屋中逃走，但通过被刀刃划开的衣服我们可以看到与武市一摸一样的烧伤伤疤。
战斗结束后听命于【胜鳞太郎】的见回组姗姗来迟，并表示坂本龙马的事情归他们负责，将新选组排除在了事件之外。
回到新选组驻地后伊东、武田和藤堂对冲田支开他们的形为明显感到不满。
回到寺田屋后与阿龙交谈，在老板娘的劝说下阿龙终于吐露实情，由此我们也得知她通过向勤王派传递消息来赚钱，同时也是给自己被新选组害死的父亲报仇。
在向阿龙表明自己的真实身份后，阿龙告诉我们新选组的山崎也许会和假的坂本龙马所有牵连，下一步行动可以通过山崎入手。
